導讀

在前幾期「代謝π析」中，我們系統探討了雙誘導倉鼠肝S9在亞硝胺類雜質遺傳毒性評估中的核心價值，以及NDMA、NDEA等陽性對照的選擇策略[13] 。

然而，Ames試驗只是倉鼠S9應用版圖中的一角。在藥物雜質安全性評估的完整體系中，還有多個關鍵試驗需要代謝活化系統的支持——從檢測基因突變的小鼠淋巴瘤試驗（MLA），到評估染色體損傷的體外染色體畸變試驗和微核試驗，再到檢測DNA鏈斷裂的彗星實驗（Comet Assay）[1, 7, 8]，倉鼠S9正在這些領域展現出獨特的價值。

（圖1：遺傳毒性評估多元試驗體系示意圖（5個試驗））

本期，我們將帶您全面了解雙誘導倉鼠肝S9在更多藥物雜質評估場景中的應用，并探討“加強版"遺傳毒性評估體系的構建策略。

一、為什么“加強版"需要多元試驗體系？

藥物雜質的遺傳毒性評估，不能僅依賴單一試驗。根據ICH M7(R2）指南，致突變雜質的評估需要綜合細菌回復突變試驗（Ames）和哺乳動物細胞試驗的數據 。

不同試驗類型檢測的遺傳損傷終點不同，對代謝活化的需求也存在差異（詳見表1）：

（表1：五大遺傳毒性試驗對比表）

劃重點：對于前致突變物（如亞硝胺類），如果在Ames試驗中僅使用大鼠S9可能漏檢，那么在其他哺乳動物細胞試驗中，同樣需要更高效的代謝活化系統。這正是雙誘導倉鼠肝S9的價值所在[7, 8, 9, 14, 15]。

二、倉鼠S9在小鼠淋巴瘤試驗（MLA）中的應用

2.1 MLA：檢測基因突變的“哺乳動物視角"

小鼠淋巴瘤試驗（Mouse Lymphoma Assay, MLA）是OECD TG 490[12]認可的體外哺乳動物細胞基因突變試驗，通過檢測L5178Y細胞tk位點的突變頻率，評估受試物的致突變性。

與Ames試驗使用細菌不同，MLA使用哺乳動物細胞，能夠：

· 檢測更廣泛的突變類型（點突變+染色體斷裂）

· 更接近人體細胞的DNA修復和代謝環境

· 為ICH M7的雜質分類提供關鍵數據

2.2 倉鼠S9在MLA中的價值

研究表明，在MLA中使用倉鼠肝S9作為代謝活化系統，對于某些前致突變物的檢測靈敏度顯著優于傳統大鼠S9方案。

核心優勢：

2.3 實操建議：MLA中的倉鼠S9使用參數

（表2：倉鼠S9在MLA試驗中的使用參數）

三、倉鼠S9在體外染色體畸變試驗中的應用

3.1 染色體畸變試驗：檢測“看得見"的損傷

體外染色體畸變試驗（OECD TG 473）[10]通過顯微鏡觀察中期分裂相細胞的染色體結構和數目異常，檢測受試物是否誘導染色體斷裂、交換、環狀染色體、多倍體等損傷。

這類損傷往往與致癌性直接相關，是遺傳毒性評估的重要組成部分。

3.2 倉鼠S9的應用價值

在染色體畸變試驗中，代謝活化系統的選擇同樣關鍵。

數據支撐：

· 研究顯示，使用誘導倉鼠肝S9活化系統與誘導SD大鼠肝S9活化系統的試驗結果接近，均可滿足體外遺傳毒理試驗需求

· 對于依賴CYP2E1活化的前致突變物，倉鼠S9體系表現出更高的致突變檢出率

3.3 實操建議：染色體畸變試驗中的倉鼠S9使用參數[11] 

（表3：倉鼠S9在染色體畸變試驗中的使用參數）

四、倉鼠S9在體外微核試驗中的應用

4.1 微核試驗：檢測染色體斷裂的“便捷指標"

體外微核試驗（OECD TG 487）通過檢測細胞質中微核的形成頻率，評估受試物的染色體斷裂或非整倍體誘導能力。相比染色體畸變試驗，微核試驗更簡便、通量更高。[15]

4.2 倉鼠S9的應用價值

體外微核試驗同樣認可使用代謝活化系統。倉鼠肝S9因其高CYP酶活性，被推薦用于前致突變物的微核試驗評估[6] 。

最新研究進展：

2025年發表的研究顯示[11]，使用30%倉鼠肝S9結合TA1535菌株，對亞硝胺類化合物的檢測靈敏度高達90%。 雖然該研究針對Ames試驗，但代謝活化原理同樣適用于微核試驗。

4.3 實操建議：微核試驗中的倉鼠S9使用參數

（表4：倉鼠S9在微核試驗中的使用參數）

五、倉鼠S9在彗星實驗（Comet Assay）中的應用

5.1 彗星實驗：檢測DNA鏈斷裂的“靈敏探針"

彗星實驗（Comet Assay，又稱單細胞凝膠電泳）是一種在單細胞水平上檢測DNA鏈斷裂的靈敏方法。當受試物為前致突變物、需要代謝活化才能產生活性代謝產物時，添加S9代謝活化系統是必要的技術手段。

（ 圖2：彗星實驗原理及S9代謝活化流程示意圖）

檢測終點：

· DNA單鏈斷裂

· DNA雙鏈斷裂

· 堿性不穩定位點

· 交聯損傷（修飾版）

5.2 倉鼠S9在彗星實驗中的價值

為什么選擇倉鼠S9？

1. 更高的CYP酶活性：Evans等[1]（2025）發表于《Mutation Research》的研究表明，誘導倉鼠S9的CYP2A6樣活性較誘導大鼠S9高出約60倍。對于依賴CYP2A6/CYP2E1活化的亞硝胺類化合物，倉鼠S9可顯著提高DNA損傷檢測靈敏度。

2. 與常用細胞系的種屬匹配：彗星實驗常用的細胞系包括V79（中國倉鼠肺成纖維細胞）、CHL（中國倉鼠肺細胞）、CHO（中國倉鼠卵巢細胞），均來源于中國倉鼠。使用金黃地鼠（敘利亞倉鼠）肝S9在種屬上更接近，具有更好的生物兼容性。

5.3 方法學參數與優化建議

在彗星實驗中添加S9代謝活化系統的方法與Ames試驗類似，但暴露時間更長[3][4] [5]：

（表5：倉鼠S9在彗星實驗中的使用參數）

經典文獻支持：Oshida等（2010）在FDC-P2細胞中使用大鼠肝S9（6%，暴露6小時）成功檢測環磷酰胺和苯并[a]芘的DNA損傷[4] 。該技術路徑同樣適用于倉鼠S9。

5.4 應用場景優先級

（表6：倉鼠S9在彗星實驗中應用場景優先級）

六、構建“加強版"遺傳毒性評估體系

6.1 為什么要“加強"？

傳統遺傳毒性評估體系（Ames+MLA+微核）對大鼠S9活化體系已經能夠檢出大多數致突變物。然而，對于亞硝胺類等依賴特定CYP酶活化的前致突變物，傳統體系存在漏檢風險[1,7,8,9]。

6.2 倉鼠S9在“加強版"體系中的角色定位[13] 

（表7：倉鼠S9在加強版體系中的角色定位）

6.3 從“單一工具"到“代謝活化矩陣"

隨著監管要求的升級，藥物雜質評估已從“一個S9走天下"演進為“多物種、多濃度、多參數"的代謝活化矩陣。

齊氏生物的建議策略（詳見下圖）[1, 7, 8, 9, 11]：

（表7：倉鼠S9在加強版體系中的角色定位）

實操總結：

（表8：倉鼠S9在不同試驗類型中的使用參數推薦表）

七、案例分享：倉鼠S9在復雜雜質評估中的多元應用

案例1：某ADC藥物連接子雜質的全面評估[16]

背景：某ADC藥物在連接子合成工藝中發現了1個NDSRI雜質。

評估策略：

· Ames試驗：使用30%倉鼠S9 + TA1535，檢出陽性

· MLA：使用10%倉鼠S9，確認基因突變風險

· 微核試驗：使用10%倉鼠S9，評估染色體斷裂風險

· 彗星實驗：使用6%倉鼠S9 + V79細胞，確認DNA鏈斷裂損傷

結果：四項試驗均呈陽性，雜質被歸類為ICH M7 Class 2，需控制在AI限值以下。

案例2：某小分子候選藥物的早期篩選[17]

背景：某小分子候選藥物結構中含有潛在的警示結構。

評估策略：

· Ames試驗：使用30%倉鼠S9 + 10%大鼠S9雙體系，確保無漏檢

· 彗星實驗：使用6%倉鼠S9快速評估DNA損傷潛力

結果：Ames試驗陰性，彗星實驗陰性，代謝穩定性可接受，項目順利推進至IND申報。

注：以上案例基于齊氏生物服務客戶的項目經驗及行業典型實踐整理，具體數據已做脫敏處理。

八、齊氏生物：您的一站式遺傳毒性評估合作伙伴

作為雙誘導金黃地鼠肝S9的專業供應商，齊氏生物為您的遺傳毒性評估提供全面支持：

8.1 核心產品線

8.2 技術服務體系

· 試驗方案設計支持：協助客戶優化S9濃度、預孵育/暴露時間等關鍵參數

· 方法驗證服務：使用陽性對照驗證S9批次活性

· NDSRI陽性對照選擇咨詢：根據雜質結構推薦交叉參照方案

· GLP體系合規支持：產品符合GLP試驗需求，已有國內多家GLP安評機構合作案例

8.3 產品優勢

結語

雙誘導倉鼠肝S9的價值，遠不止于Ames試驗。

從小鼠淋巴瘤試驗（MLA）到染色體畸變試驗，從微核試驗到彗星實驗，倉鼠S9正在構筑藥物雜質評估的“代謝活化矩陣"。在亞硝胺類雜質監管日趨嚴格的今天，擁有一個高效、可靠的代謝活化系統，是確保遺傳毒性評估不漏檢、合規申報的關鍵保障。

齊氏生物將繼續致力于提供高品質的倉鼠肝S9產品和專業的技術服務，助力您的藥物研發項目安全、高效地推進。

本期是「代謝π析·倉鼠S9專題」的第4篇。下一期，我們將繼續探討倉鼠S9在藥物代謝動力學研究中的更多應用，敬請期待。

了解更多倉鼠S9產品詳情，或獲取遺傳毒性評估方案支持，歡迎聯系齊氏生物。

參考文獻

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[2] Geijer ME, Gernaat AM, Moelijker N, Brandsma I, Hendriks G. An enhanced metabolization protocol for in vitro genotoxicity assessment of N-nitrosamines in mammalian cells[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2025. (Wiley, in press)

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[12] OECD. Test No. 490: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests Using the Thymidine Kinase (Tk) Gene[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2016.

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[17]International Council for Harmonisation. ICH M7(R2): Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk[S]. 2023. (警示結構評估與Ames篩查的法規框架)